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作为神经系统信息交流的“通货”,ç¥?/span>ç»?/span>电活动是大脑处理复杂信息çš?/span>物理基础ã€?/span>ä¸?/span>膜片钳和微电极阵åˆ?/span>记录ç?/span>基于电极材料çš?/span>传统电生理技æœ?/span>相比ï¼?/span>荧光膜电ä½?/span>成像åœ?/span>时空分辨率、测量通量等方面具有明显的优势。其中,发射波长åœ?/span>远红区(640 nm以上)的荧光探针由于其红移的光谱具有更强组织穿透能力,而且å�?/span>适于å¤?/span>通路成像观测,因而备å�?/span>研究人员青睐ã€?/span>然而目前可使用çš?/span>远红åŒ?/span>膜电位探é’?/span>åœ?/span>亮度和灵敏度方面存在严重缺陷,因æ?/span>亟需发展适用于记录神经元动作电位的高性能荧光探针ã€?/span>
2021å¹?/span>4æœ?/span>15æ—?/span>,北京大学化学与分子工程学院邹鹏课题组与陈鹏课题ç»?/span>共同åœ?/span>Nature Chemistry杂志在线发表了他们最新的研究成果â€?/span>A far-red hybrid voltage indicator enabled by bioorthogonal engineering of rhodopsin on live neuronsâ€?/span>ã€?/span>他们综合利用生物正交反应和膜蛋白工程åŒ?/span>改造策略,开å�?/span>å‡?/span>一系列具有高灵敏度和成像信噪比çš?/span>荧光膜电位探é’?/span>HVIï¼?/span>hybrid voltage indicatorï¼?/span>ã€?/span>根据成像光谱需求,HVI的蛋ç™?/span>è´?/span>骨架å�?/span>借助生物正交反应搭配不同化学结构的荧光染料,构建出一系列跨越可见光谱çš?/span>复合型探针。其中,橙红区探é’?/span>HVI-Cy3具有最高的灵敏度,能够以高è¾?/span>90的信噪比成像记录神经动作电位ï¼?/span>远红åŒ?/span>探针HVI-Cy5具有最红移的光谱,不仅可与绿色或红è‰?/span>荧光探针同时使用,实现膜电位ä¸?/span>é’?/span>离子、神经递质ç?/span>重要生理信号的并行观测,还能å¤?/span>与光遗传学工具联ç”?/span>ï¼?/span>实现全光å?/span>神经电生理检测ã€?/span>

å›?/span>1 复合型膜电位探针HVI检测神经元膜电ä½?/span>概念å›?/span>
邹鹏课题组长期致力于发展和应用化学探针技术,研究参与神经信号转导过程的生物大分子、支配神经活动的化学和物理信号。他们率先提å‡?/span>“复合型膜电位探针”的概念ï¼?/span>利用化学手段将荧光染料与视紫红质蛋白ç›?/span>偶联ï¼?/span>利用后者的电致变色效应实现膜电位成åƒ?/span>ï¼?/span>Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 3949-3953)ã€?/span>陈鹏课题组长期致力于发展适用于活细胞及活体动ç‰?/span>的生物正交反应,å¹?/span>通过遗传编码技术,实现了蛋白质的特异标记、激活与调控ï¼?/span>Nat. Chem. Biol. 2016, 12, 129-137ï¼?/span>ã€?/span>在最新的研究成果中,两个课题ç»?/span>合作,将化学反应策略与蛋ç™?/span>è´?/span>骨架改é€?/span>相结å�?/span>,对神经元的膜蛋白进行了原位çš?/span>“生物正交”工程优åŒ?/span>ã€?/span>一方面ï¼?/span>鉴于目前大多数生物正交反应难以高效地标记膜蛋白,以及点击化学反应(铜催化炔基-叠氮环加成反应)å¯?/span>神经å…?/span>的毒æ€?/span>ï¼?/span>他们æ”?/span>ç”?/span>äº?/span>生物相容性更å¥?/span>、效率更é«?/span>的逆电子需æ±?/span>狄尔æ–?/span>-阿尔å¾?/span>反应ï¼?/span>IEDDA),将高荧光量子产率çš?/span>远红åŒ?/span>染料引入工程改造的视紫红质蛋白的特异位ç‚?/span>ã€?/span>另一方面ï¼?/span>他们针对视紫红质蛋白Ace2中的关键质子受体氨基酸残åŸ?/span>进行突变筛é€?/span>,最终得到了消除稳态光电流ä¸?/span>亮度及灵敏度显著提升的远红区复合型探é’?/span>HVI-Cy5ã€?/span>当神经元膜电势发ç”?/span>去极化时,质子电化学åŠ?/span>的改变促进视黄醛席夫碱的质子åŒ?/span>,从而改变视紫红质的吸收光谱,最终通过FRET效应影响其偶联荧光染料的量子产率,导致荧光信号变åŒ?/span>(图2ï¼?/span>ã€?/span>

å›?/span>2复合型膜电位探针HVI荧光标记方法示意图及探针响应细胞膜电位变化原ç�?/span>å›?/span>
实验表明ï¼?/span>HVI-Cy5可与光遗传学工具联用(图3ï¼?/span>。研究人å‘?/span>用短波长å…?/span>单向或者双向调æŽ?/span>神经元兴奋性,同时åœ?/span>远红åŒ?/span>荧光通道记录膜电位变åŒ?/span>ï¼?/span>扩充了全光学电生理学工具ç®?/span>(图3a-cï¼?/span>ã€?/span>该技术相比于传统的多电极膜片钳刺激并记录,技术难度明显下降ã€?/span>HVI-Cy5还可以与其他荧光探针进行双色成像,无串扰监测细胞膜电势及钙离子、递质å’?/span>pH等生理信å�?/span>(图3d-fï¼?/span>。多色成像将帮助研究者更好地了解膜电位与其他生理信号动态变化的联系和差异ã€?/span>

å›?/span>3具有深红荧光光谱çš?/span>HVI-Cy5可与光遗传学工具及钙探针联用实现全光学电生理检æµ?/span>
此外ï¼?/span>实验å°?/span>HVI-Cy5ä¸?/span>光遗传学工具分别表达åœ?/span>不同的大鼠海马体神经å…?/span>ä¸?/span>ï¼?/span>利用膜电ä½?/span>成像评估APVå’?/span>NBQX两种药物对神经元突触连接çš?/span>影响ï¼?/span>解析äº?/span>NMDARå’?/span>AMPARä¸?/span>ç±?/span>谷氨酸受体对突触信号传递的贡献ï¼?/span>å›?/span>4ï¼?/span>ã€?/span>未来ï¼?/span>HVI-Cy5æœ?/span>æœ?/span>用于åœ?/span>体外筛选作用于受体蛋白的激动剂或拮抗剂ã€?/span>

å›?/span>4 å°?/span>HVI-Cy5与光遗传学工具分别表达在不同神经元中å�?/span>以研究药物对神经突触的作ç”?/span>
总之ï¼?/span>本文通过对视紫红质膜蛋白的“生物正交”工程优化,发展了适用äº?/span>神经元电信号记录çš?/span>远红åŒ?/span>高性能荧光探针HVI-Cy5ï¼?/span>实现多色成像和全光学电生理学应用,期待该探针能够帮助研究者解读更加复杂的神经元电生理信号ã€?/span>
北京大学化学与分子工程学院博士研究生刘书彰、林畅,北大-清华生命联合中心博士毕业生胥永显(现浙江大学医学中心博士后)为该论文的共同第一作者ã€?/span>北京大学化学与分子工程学é™?/span>邹鹏研究员和陈鹏教授为该论文的共同通讯作者ã€?/span>该工作得到了国家自然科学基金委、科技部、生物有机与分子工程教育部重点实验室、北京分子科学国家研究中心和北大-清华生命科学联合中心的资助ã€?/span>
原文链接ï¼?/span>//www.nature.com/articles/s41557-021-00641-1